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DNA提取途径对微生物组研究的结果有多大影响?

综合 时间:2021-09-22 18:00:21 匿名用户

让我们面对现实,我们是一个结果驱动的社会。过于关注结果,人们通常不会想到“如何”的问题。例如,你是想“如何”今天早上开始工作还是刚刚开始?在微生物组学研究中,结果是图表和数据,但“如何”和通勤一样,通常只是日常工作的一部分。

然而,分析微生物组的一个基本方面(无论宿主为何)依赖于DNA提取和扩增方法。目前市场上有几十种DNA提取方法,每种都能提取DNA并产生良好的结果,但每种方法的“方式”略有不同。实验室通常都有由实验室负责人选择的“go-to”工具包,并一代一代地传给研究生。一旦你选择了一种方法,最好还是坚持这种方法,因为每个人都知道不同的工具会产生稍微不同的结果。但是哪种方法是最好的呢?你怎么选择?“如何”对结果有多大影响?你应该什么时候换?

在任何项目开始时,通常都会详细讨论实验设计和样本采集,但DNA提取方法往往被忽视。这种忽视DNA提取方法重要性的隐现偏见成为研究人员Cecelia Giangacomo及其顾问Jason G.Wallace在其最新《植物生物群落》杂志出版物《比较DNA提取和16S rRNA基因扩增方法对植物相关细菌群落的影响》中的焦点问题,“这项研究让我们知道未来最好/最有效的方法。我们的实验室做了很多植物微生物组学的工作,所以我们想确保我们能很好地利用这些资源。事实上,我很惊讶以前没有人这么做过,所以我们希望其他实验室发现它有用。”

DNA提取试剂盒被设计为适用于微生物及其宿主的广谱试剂盒。在大多数植物微生物组项目中,与宿主相比,微生物组DNA的数量将非常少。因此,微生物组测序的最大挑战是优化样本中大量宿主DNA中微生物DNA的提取。

一旦提取出DNA,研究人员通常会从样本中的所有生物体中扩增出一段DNA。这段DNA在各种感兴趣的物种中都是保守的,但不同物种之间的差异足以描述样本中的多样性。调查细菌最常见的目标之一是16S核糖体RNA基因-也存在于植物叶绿体中。因此,尽管这种扩增方法能够很好地将人体和环境样本中的宿主与微生物分离,但它仍然会在植物样本中产生宿主污染(通过叶绿体扩增)。

华莱士和他的团队比较了四种常见的商用DNA提取方法:DNeasy Plant(Qiagen)、Quick DNA(Zymo)、Extract-N-Amp(Sigma-Aldrich)和Power Soil Kit(Qiagen)。他们还研究了四种针对16S核糖体RNA基因特定区域的不同扩增方法,以确定哪种方法在保留微生物DNA的同时排除宿主DNA的效果最好。

研究人员可以针对宿主DNA进行选择的一种方法是修改扩增过程。华莱士和他的同事们研究了如何添加分子钳来抑制叶绿体和线粒体DNA,从根本上阻止不需要的DNA的扩增。他们还试图扩增16S基因的一个不同区域,该区域将区别叶绿体和线粒体,从而产生更多的微生物组DNA扩增。他们优化扩增过程的最终方法是使用“毒害”不需要的DNA的序列,这样就不能进一步扩增。

这个过程类似于在通勤途中走多条路线。每一个都可能有一些重叠的风景,但也有独特的属性;一个可能更美丽,一个更快,另一个压力更大。在华莱士的研究中,他们可以使用不同的提取和扩增途径来比较这些方法的“如何”影响总体结果。虽然大多数研究人员知道他们的方法存在偏差,但这是一个直接的并排比较,显示了每种方法如何产生不同的结果并改变了样本的总体组成。华莱士说:“这项研究应该帮助人们在如何花费时间和金钱进行微生物组研究方面做出最佳选择。”。

华莱士强调,没有“完美的方法”,即使在他们的研究中,有些方法对某些样本类型效果更好,但对其他样本类型效果不佳。这些数据为研究人员提供了知识,以便就其方法做出更明智的决策。对于特定的项目、样本、类型或预算,即使是这里最好的方法也可能不是最好的方法。公司不断地尝试优化他们的产品,所以随着我们的前进,这一挑战有望对研究人员变得更容易。

最重要的是,这项研究使人们认识到,不同的方法会影响结果。没有“完美的方法”。这取决于研究人员理解他们样本的细微差别,并为他们希望解决的科学问题选择最佳方法。所以,尽管所有的道路都可能会有结果,但尝试“如何”可能值得努力找到微生物组研究的最佳途径。华莱士解释说:“这不是一个范式的转变,但它是一个小的、渐进的变化,帮助我们更好地进行研究,随着时间的推移,这些变化加起来会带来相当大的改进。”。

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