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消除基因工程的猜测:STAMPScreen管道有助于简化哺乳动物细胞的基因研究

综合 时间:2021-09-28 10:00:08 匿名用户

今天的基因工程师拥有大量的资源可供使用:在线提供的海量数据集数量不断增加,CRISPR等高精度基因编辑工具,以及廉价的基因测序方法。但是,新技术的激增并没有一个清晰的路线图来帮助研究人员确定哪些基因是目标,哪些工具可以使用,以及如何解释他们的结果。因此,哈佛Wyss生物灵感工程研究所、哈佛医学院(HMS)和麻省理工学院媒体实验室的一组科学家和工程师决定制作一个。

Wyss团队已经创建了一个综合管道,用于进行基因筛查研究,包括从确定感兴趣的目标基因到快速高效地克隆和筛查基因的每一个步骤。该协议称为基于序列的目标确定和模块化扰动筛选(STAMPScreen),在Cell Reports Methods中进行了描述,相关的开源算法可在GitHub上获得。

通讯作者Pranam Chatterjee博士说:“STAMPScreen是一个简化的工作流程,使研究人员能够轻松地识别感兴趣的基因并进行基因筛查,而无需猜测使用哪种工具或进行什么实验来获得他们想要的结果。”。,他曾是麻省理工学院媒体实验室的研究生,现在是HMS和Wyss研究所的Carlos M.Varsavsky研究员。“它与许多现有的数据库和系统完全兼容,我们希望许多科学家能够利用STAMPScreen节省时间并提高结果的质量。”

挫折是发明之母

Chatterjee和该论文的第一作者Christian Kramme对此感到沮丧。这两位科学家试图通过结合数字方法(思考算法)和基因工程(思考基因测序)的优势,探索生物学不同方面的基因基础,如生育、衰老和免疫。但他们在使用各种工具和协议时不断遇到问题,这在科学实验室中很常见。

这些算法旨在筛选生物体的基因,以识别那些对特定生物过程有重大影响的基因,它们可以判断基因的表达模式何时发生了变化,但没有提供任何关于这种变化原因的见解。当他们想在活细胞中测试一系列候选基因时,还不清楚他们应该进行什么样的实验。许多可用于将基因插入细胞并对其进行筛选的工具都是昂贵、耗时且缺乏灵活性的。

“我当时使用的是金门和网关(Golden Gate and Gateway)的方法将基因克隆到载体上进行筛选实验,克隆50个基因花了我几个月和数千美元。而使用Gateway,我无法对基因进行物理条形码识别哪个基因进入了哪个载体,这是我下游基于测序的实验的关键要求实验设计。我们认为必须有一种更好的方法来进行这类研究,当我们找不到一种时,我们就自己承担了创造它的挑战,”Wyss Institute和HMS的研究生Kramme说,

Kramme与第一作者之一、教会实验室成员Alexandru Plesa合作,Alexandru Plesa在为他的项目制作基因载体时遇到了同样的挫折。Kramme、Plesa和Chatterjee随后开始工作,概述建立基因筛查端到端平台所需的内容,该平台将适用于他们所有的项目,从蛋白质工程到生育和衰老。

从头到尾

为了改进遗传研究的早期阶段,识别感兴趣的基因进行研究,该团队创建了两种新算法,以帮助满足对计算工具的需求,这些工具可以分析和提取通过下一代测序(NGS)生成的越来越大的数据集中的信息。第一种算法获取有关基因表达水平的标准数据,并将其与有关细胞状态的信息以及已知哪些蛋白质与基因相互作用的信息相结合。该算法对与其他基因高度相关且其活性与细胞水平的巨大变化相关的基因给予高分。第二种算法通过生成网络来表示细胞类型分化过程中基因表达的动态变化,然后应用中心性度量(如谷歌的PageRank算法)对过程的关键调节器进行排序,从而提供更高层次的洞察力。

“遗传研究的计算部分就像一个Jenga游戏:如果塔中的每个区块代表一个基因,那么我们正在寻找构成Jenga塔底部的基因,这些基因支撑着整个塔。大多数算法只能告诉你哪些基因彼此在同一行,但我们的算法允许你知道到底有多远或多远。”拥有它们所在的塔,这样你就可以快速识别出对细胞状态影响最大的塔,”Chatterjee说。

一旦确定了目标基因,STAMPScreen协议将从笔记本电脑转移到实验室,在那里进行实验来破坏细胞中的这些基因,并观察扰动对细胞的影响。研究团队系统地评估了多种基因微扰工具,包括互补DNA(cDNA)和人类诱导多能干细胞(HIPSC)中的CRISPR的几种版本,这是第一个已知的完全在这种高度通用但具有挑战性的细胞类型中进行的头对头比较。

然后,他们创造了一种新的工具,允许在同一细胞内使用CRISPR和cDNA,以释放这两种方法之间的协同作用。例如,CRISPR可用于关闭基因所有亚型的表达,而cDNA可用于顺序单独表达每个亚型,从而允许进行更细致的遗传研究,并大大减少非目标基因的背景表达。

扫描库条形码

许多基因实验的下一步是生成一个筛选文库,用于将基因导入细胞并观察其效果。通常,基因片段插入细菌质粒(环状DNA片段)的方法对小片段DNA很有效,但插入较大基因时使用起来很麻烦。许多现有的方法还依赖于一种称为Gateway的技术,该技术使用一种称为lambda噬菌体重组的过程和毒素的产生来杀死任何没有接收到含有感兴趣基因的质粒的细菌。这些质粒中的毒素通常很难在实验室中使用,而且当向载体中添加“条形码”序列以帮助研究人员识别载体接收到的携带基因的质粒时,毒素可能会意外失活。

Kramme和Plesa当时正在与Gateway合作,他们意识到如果他们消除毒素并用质粒上的短序列取代它,这些序列将被一种称为巨核酸酶的酶识别和切割,这些问题就可以解决。巨核酸酶识别序列不会出现在任何已知生物体的基因中,因此确保该酶不会在克隆过程中意外切割插入的基因本身。当质粒接收到感兴趣的基因时,这些识别序列自然丢失,使这些质粒对巨核酸酶免疫。然而,任何不能成功接收感兴趣基因的质粒都保留这些识别序列,并在添加巨核酸酶时被切割成碎片,只留下含有插入基因的纯质粒池。研究人员称之为MegaGate的新方法,克隆成功率为99.8%,并且使他们能够轻松地对载体进行编码。

“MegaGate不仅解决了我们在旧的克隆方法中不断遇到的许多问题,它还与许多现有的基因库(如TFome和Horfome)兼容。你基本上可以从货架上取下Gateway和Meganuclareases,将它们与一个基因库和一个条形码目的载体库以及两个几个小时后,你就有了感兴趣的条形码基因。我们已经用它克隆了近1500个基因,但还没有失败,”怀斯研究所和英国皇家医学院的研究生普莱萨说。

最后,研究人员证明,他们的条形码载体可以成功地插入到活的HIPSC中,并且可以使用NGS分析细胞池,以确定该池中表达了哪些传递的基因。他们还成功地使用了多种方法,包括RNA-Seq、TAR-Seq和Barcode-Seq,来读取HIPSC的遗传条形码和整个转录组,使研究人员能够使用他们最熟悉的工具。

该团队预计STAMPScreen将被证明对多种研究有用,包括通路和基因调控网络研究、分化因子筛选、药物和复杂通路表征以及突变建模。STAMPScreen也是模块化的,允许科学家将其不同部分集成到自己的工作流程中。

“公开的基因数据集中蕴藏着丰富的信息,但这些信息只有在我们使用正确的工具和方法进行分析时才能被理解。STAMPScreen将帮助研究人员更快地到达eureka,加快基因工程创新的步伐,”资深作者George Church博士说。,Wyss核心教员,同时也是英国皇家医学院遗传学教授,哈佛大学和麻省理工学院健康科学与技术教授。

“在Wyss研究所,我们的目标是为紧迫的问题提供有效的‘登月’解决方案,但我们知道,要想登上月球,我们必须首先建造一枚火箭。这个项目是我们社区如何在飞行中创新以实现将改变世界的科学突破的一个很好的例子,”Wyss创始主任Don Ingber说,医学博士,博士,同时也是英国皇家医学院血管生物学和波士顿儿童医院血管生物学项目的犹大·福克曼教授,以及哈佛大学约翰·A·保尔森工程与应用科学学院的生物工程教授。

论文的其他作者包括海伦·王、贝内特·沃尔夫、梅里克·斯梅拉、郭晓歌博士和里奇·科曼博士。来自Wyss研究所和HMS。

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